详情

猪流行性腹泻病毒RPA检测方法的建立

申报人:杨志彪 申报日期:2021-09-24

基本情况

第二十四期“上海交通大学大学生创新实践计划”项目
猪流行性腹泻病毒RPA检测方法的建立
创新训练项目
农学
动物医学类
创新类
农业与生物学院
杨志彪
指导教师
登录状态下查看

1.   RPS3A调控PEDV复制的分子机制研究,上海市自然基金,编号:经费:20万元,2021-2024

2.   PEDV与宿主细胞蛋白互作的分子基础研究,国家重点研发计划子课题(所属项目:新发与再现畜禽重大疫病的致病与免疫机制研究,课题:仔猪腹泻冠状病毒感染及其致病机理),编号:2016YFD0500102-7,经费:93万元,2016.7-2020.12

3.   小型猪动脉粥样硬化模型及可降解镁合金血管支架植入治疗的功效性研究,上海交通大学Agri-X基金,项目编号:上海交通大学Agri-X(2015),经费:40万元,2015.9-2018.8

4.   猪流行性腹泻病毒(PEDVS蛋白介导细胞侵染的分子机制,国家自然科学基金面上项目,项目编号:31472211,经费90万元,2015.1-2018.12

5.   新流行猪流行性腹泻病毒(PEDV)侵染细胞受体的鉴定及功能分析,上海市自然基金,项目编号:14ZR1421400,经费10万元,2014.6-2017.6

本课题组一直从事猪流行性腹泻相关冠状病毒病的研究,其中针对猪流行性腹泻病毒的病原学、流行病学、免疫与致病机理等开展了大量研究工作,先后主持了国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划子课题等十余项国家和省部级课题的研究工作,这些项目的研究内容大部分都涉及到本项目的研究对象猪流行性腹泻病毒,为本项目的实施积累了丰富实验材料,奠定了扎实的理论基础。课题组分离了多株遗传背景清晰和不同来源的PEDV分离株;完成了不同PEDV全长基因组序列测定和遗传演化分析,制备了针对PEDV不同结构蛋白的多株特异性单克隆抗体,建立了PEDV分离株IFART-qPCR等系列检测方法以及动物感染模型,这些研究为后续开展猪流性腹泻病毒RPA检测方法积累了研究的实验条件、实验材料和技术储备,能够完成预期目标。

本项目主要拟建立猪流性腹泻病毒RPA检测方法。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是发明与2006年的一种新型恒温体外核酸扩增技术。利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,实现对核酸的快速、特异扩增,在23~45℃恒温条件下加热5——20分钟,即可完成扩增。可代替传统PCR热循环中的变性和复性过程。

RPA反应过程中,重组酶先与引物结合,寻找双链DNA中的同源序列,定位到同源序列后,发生链交换,启动DNA合成反应,单链结合蛋白(SSB)与亲本链结合,防止被进一步替换。合成的子代DNA重复合成过程,如此循环重复进而实现扩增。

RPAPCR的引物设计区别在于引物的长度的不同,一般情况下RPA的引物长度是比PCR长,引物长度过短会影响重组酶的活性,单链结合蛋白需要寡寡核苷酸长度在30~35bp以上才能将其整合到双链DNA。模板的长度通常在90bp400bp之间,由于引物长度限制在30bp35bp之间,所以最佳扩增长度是100bp200bp,并且尽量避免聚嘧啶和聚嘌呤的情况。此外,在引物的设计过程中,5’端尽量避免有多个鸟嘌呤(G),引物的GC含量在40%60%之间;避免引物形成二聚体和二级结构。3’端错配若超过一个碱基,会影响RPA反应的进行。在引物两端和中心若有3个碱基发生错配,则会影响RPA反应的检测效率。

普通PCR检测方法耗时长,操作复杂,且对实验环境要求高。恒温体外核酸扩增技术使得现场核酸检测成为可能,操作简单,联合测流试纸检测方法,将核酸检测可视化,提升其检测的便捷性,同时优化后的核酸检测技术保障检测的灵敏性和特异性。使得养殖场PEDV监测便利,提高国内PED流行监测的水平和能力。

选题成员

0

指导教师

序号 教师姓名 电子邮箱 所属学院
1 杨志彪 登录状态下查看 农业与生物学院 第一指导教师

选题附件

结束