1. 主持  国家自然科学基金青年基金（32102346），VvMAX1介导独脚金内酯调控根域限制葡萄根系构型的作用机理解析，24万元，2022/01-2024/12，

2. 主持  上海市青年科技英才扬帆计划项目（21YF1422100），VvMAX1介导SLs调控根域限制葡萄根系构型的作用机理解析，20万元，2021/05-2024/04；

3. 主持  上海交通大学“新进青年教师启动计划”（21X010500643），独脚金内酯调控根域限制葡萄根系构型的作用机理解析，5万元，2020/09-2023/12。

 指导教师长期从事果树分子生物学和遗传育种相关工作，有充足的科研经费支撑本实验顺利开展，也有充足的时间指导学生的科研工资。且前期已经对本课题进行部分初探，首先，利用独脚金内酯类似物GR24通过组培体系处理‘玫瑰香’葡萄，通过观察根系表型发现，相较于激素空白对照组，GR24处理能够抑制葡萄侧根的形成和伸长，且高浓度GR24 (10 μmol)处理组的对侧根的抑制效果要显著高于低浓度GR24 (0.1μmol)处理组。此外，GR24处理能显著抑制葡萄不定根发生和伸长。因此，由上述结果也初步表明，独脚金内酯可能参与调控根域限制葡萄的根系构型建成。其次，在以上研究基础上，本课题拟对葡萄VvMAX1基因开展深入的功能解析和转录调控研究。通过基因克隆和序列分析表明，VvMAX1基因CDS全长1593 bp，编码530个氨基酸，等电点是9.23，相对分子质量是59.88 kDa。氨基酸序列分析结果显示，VvMAX1属于细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，P450）超级家族，含有一个保守的P450 domain（氨基酸49-515）。前期对VvMAX1的转录活性进行了分析，结果表明VvMAX1不存在转录激活活性。目前，已完成葡萄样品的酵母单杂交文库的构建工作，下一步计划进行酵母单杂交文库筛选工作。

一、主要研究内容

1. VvMAX1基因在葡萄根系发育中的功能研究

A. VvMAX1蛋白的活性鉴定

通过生物信息学手段预测VvMAX1的功能域；利用酵母蛋白表达系统和葡萄叶片瞬时转化实验鉴定VvMAX1蛋白的催化活性。

B. VvMAX1基因在葡萄根系发育中的功能研究

① 将葡萄VvMAX1回补拟南芥max1突变体，比较野生型、max1突变体和回补材料的植株表型（地上部和根系发育状况），明确葡萄VvMAX1是否与拟南芥AtMAX1发挥着相同的生物学功能。
       

二、研究目标

（1）揭示VvMAX1基因在葡萄根系发育中的生物学功能。

三、拟采取的研究方案

        （1）VvMAX1基因在葡萄根系发育中的功能研究

为解析VvMAX1基因在葡萄根系发育中的功能，拟通过酵母蛋白表达系统和葡萄叶片瞬时表达实验、max1突变体回补实验以及葡萄转基因进行系统研究，具体研究方案如下：

A. 利用酵母蛋白表达系统提取蛋白，测定VvMAX1的蛋白催化活性

克隆葡萄VvMAX1基因全长序列，通过TMHMM、Pfam等生物信息学网站预测VvMAX1的功能域。构建pPIC9K-VvMAX1表达载体，通过电转法（参数设置1.5 kV，25 UF，200 Ω）将其转化毕赤酵母菌株GS115，筛选Mut⁺（甲醇利用效率高的菌株）和Mut^S（甲醇利用效率低的菌株），分别利用上述两种表型的菌株表达目的蛋白，通过均质仪破碎酵母细胞，提取酵母总蛋白，利用镍柱亲和层析和快速蛋白液相色谱（FPLC，G200 Superdex column），获得高纯度的表达蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳检测，同时利用Western blotting检测纯化蛋白的正确性，参照Chen et al., 2004, Science, 303, 2022-2025中的方法开展Western blotting试验。多克隆His标签抗体购自上海英俊生物科技有限公司。VvMAX1蛋白的催化活性测定方法参照Zhang et al., 2018, New Phytologist, 219, 297-309。

B. 葡萄叶片瞬时表达分析VvMAX1蛋白的催化活性

构建VvMAX1基因的植物过表达载体，转化农杆菌GV3101。以‘玫瑰香’葡萄组培苗为实验材料，统一选取第3、4叶位的叶片，在其表面扎上若干小孔后，放入装有30 mL混合菌液（包含已转化目的基因的农杆菌GV3101和保护菌P19）的注射器中，将注射器口封上，迅速拉至60 mL刻度处，重复3次，直至菌液完全渗入。用灭菌纸拭去叶片上残留的菌液，将叶片置于底部铺有湿润纱布的大玻璃皿中，正面朝上，于28℃恒温培养箱中黑暗培养12 h，转移至光照培养箱培养3~4天，然后提取叶片中的VvMAX1蛋白，并测定该蛋白的催化活性，提取和活性测定方法参照Zhang et al., 2018, New Phytologist, 219, 297-309。

C. 葡萄VvMAX1回补拟南芥max1突变体实验

构建VvMAX1基因过表达载体，回补拟南芥max1突变体，以明确葡萄VvMAX1是否与拟南芥AtMAX1具有相同的生物学功能。具体步骤为：①构建VvMAX1基因的过表达pHB载体，载体构建原理参照Li et al., 2020, Plant Physiology and Biochemistry, 149, 190-200；② 转入农杆菌GV3101，利用蘸花法转化拟南芥max1突变体；③ 利用潮霉素筛选和T2代筛选结果的卡方检验以及Southern blotting鉴定得到单拷贝插入的转基因阳性植株；Southern blotting具体操作方法参照申请人前期已发表论文（Jiu et al., Functional & Integrative Genomics, 2016, 16, 595-617）；④ 观察野生型、max1突变体以及max1回补材料的地上部腋芽数、莲座叶形状和直径、植株高度以及地下部主根和侧根的长度、粗度和数量以及根毛的长度和密度等生长发育指标（Lazar G and Goodman HM, PNAS, 2006,103, 2）。

四、可行性分析

（1）技术体系完善，技术方案可行

指导老师纠松涛博士长期从事葡萄栽培生理和生长发育调控的相关研究工作。在国家博士后创新人才支持计划、上海市“超级博士后”激励计划、中国博士后科学基金等项目的支持下，申请人的实验素养和科研能力得到了很好的锻炼，已经熟练掌握了本项目中所涉及的实验技术方法，如SLs等内源激素测定、蛋白表达及纯化、拟南芥转基因、Southern blotting、Western blotting、SDS-PAGE、酵母单杂交、EMSA、烟草双荧光素酶、葡萄瞬时和稳定转化等。同时，项目组拥有本项目所需的全部菌株、植物表达载体和拟南芥突变体等实验材料。上海交通大学果树研究室葡萄基地培养有‘玫瑰香’、‘巨峰’、‘阳光玫瑰’等10余个葡萄品种，为本项目的顺利开展提供了充足的实验材料和便利的研究条件。另外，项目申请人所在研究团队与中国农科院郑州果树所“国家葡萄种质资源圃”、中科院上海植物生理生态研究所、华大基因等多家科研机构建立了良好的合作关系，确保项目在技术上是可行的。因此，从试材和技术都进行了充足的准备，为项目的顺利实施奠定了坚实的基础。

（2）研究平台良好，实验条件完善

本项目依托上海交通大学葡萄与葡萄酒科学中心、国家葡萄产业技术体系葡萄栽培岗位研究平台，具备较完善的葡萄栽培生理及分子生物学实验技术体系。同时，申请人所在研究团队与中科院上海植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室（代码14918607）建立有良好的合作关系，完全可以保证本项目所需的实验条件。

（3）研究基础扎实，工作进度合理

指导老师团队已具有与本项目相关的研究基础（详见“研究基础与工作条件”部分）。申请人在攻读博士学位和博士后研究阶段开展的有关葡萄果实着色机理（Jiu et al., 2020, Plant Biotechnology Journal, pp, 1-24）和ABA调控果实发育成熟（Jia^# and Jiu^#, 2016, Plant Biotechnology Journal, 14, 2045-2065）等方面的研究也为本项目的完成提供了成熟的实验技术支撑和研究方法。同时，本项目根据研究内容、各部分实验所需时间长短及难易程度，合理地进行了工作进度安排，具有在预期时间内完成该项目的条件。

五、时间进度进度：

2022年1月1日-10月30日 完成实验相关内容

2022年11月1日-12月31日 完成PRP论文撰写、答辩